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哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為哺乳動(dòng)物模型構(gòu)建提供了簡(jiǎn)便、快速的方法，也為基因疾病的治療提供新思路、新方法。泓迅生物繼質(zhì)粒DNA后全新推出CRISPR RNP介導(dǎo)的細(xì)胞基因編輯服務(wù)：平臺(tái)依托先進(jìn)的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)豐富的科研團(tuán)隊(duì)，為您打造從方案設(shè)計(jì)、sgRNA設(shè)計(jì)及化學(xué)合成、高活性重組Cas9蛋白，RNP復(fù)合物組裝到敲除細(xì)胞系構(gòu)建的全流程服務(wù)。

服務(wù)優(yōu)勢(shì)

全模式物種CRISPR sgRNA設(shè)計(jì)
sgRNA化學(xué)合成純度高達(dá)99%以上
重組Cas9蛋白純度高達(dá)99%以上
最快至2周交付

服務(wù)詳情

服務(wù)項(xiàng)目	交付內(nèi)容	交付周期
方案設(shè)計(jì)	專(zhuān)業(yè)的分析報(bào)告設(shè)計(jì)序列	咨詢(xún)
合成與組裝	化學(xué)合成修飾化的sgRNA 高活性、高純度的Cas9蛋白 RNP復(fù)合物組裝	咨詢(xún)
敲除細(xì)胞系構(gòu)建	多克隆細(xì)胞群或單克隆細(xì)胞株提供細(xì)胞基因型復(fù)檢、擴(kuò)增及凍存	咨詢(xún)
驗(yàn)證	DNA水平檢測(cè) 蛋白水平檢測(cè)	咨詢(xún)

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服務(wù)流程

案例分享查看詳細(xì)

1、利用RNP下的雙sgRNA編輯法，實(shí)現(xiàn)基因DNA水平片段敲除
案例：對(duì)X細(xì)胞的A基因進(jìn)行Exon1-13的片段敲除（KO）
（1）在需求敲除片段兩端分別設(shè)計(jì)1條高靶向的sgRNA序列，如下圖：
gene KO

（2）將gRNA-A1、gRNA-A2進(jìn)行化學(xué)修飾合成后分別與Cas9蛋白組裝成RNP，轉(zhuǎn)染至X細(xì)胞進(jìn)行A基因片段序列敲除；

（3）敲除結(jié)果檢測(cè)如下：
DNA水平-Sanger測(cè)序顯示，A基因序列已被敲除，結(jié)果如下：

細(xì)胞表型檢測(cè)如下圖：A為正常細(xì)胞，B為A基因敲除后的突變細(xì)胞形態(tài)，表明A基因被敲除。
RNP基因敲除

2、RNP敲除效率遠(yuǎn)超傳統(tǒng)質(zhì)粒法
案例：以AAVS1位點(diǎn)敲除為例，比較質(zhì)粒（DNA）與RNP的敲除效率
（1）將AAVS1-sgRNA1序列構(gòu)建帶有Cas9的載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后提取基因組DNA，以基因組DNA為樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序并結(jié)合Synthego ICE分析軟件檢測(cè)，結(jié)果顯示敲除率為14%；

（2）將AAVS1-sgRNA1 RNP復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行如（1）所述檢測(cè)，結(jié)果顯示敲除效率為69%；
RNP敲除效率

（3）敲除效率比較（如下圖），結(jié)果顯示RNP敲除效率是質(zhì)粒法的4-5倍，顯著高于質(zhì)粒法。
RNP敲除法

常見(jiàn)問(wèn)題

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯過(guò)程中，需要注意哪些問(wèn)題？

1.細(xì)胞培養(yǎng)與選擇：

選擇適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞類(lèi)型，如CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞系、NS0和Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞、HEK293（人胚胎腎293）細(xì)胞等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枰x擇適合的細(xì)胞系。

2.確保細(xì)胞的質(zhì)量和純度，采用合適的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分裂。

靶位點(diǎn)的選擇與sgRNA的設(shè)計(jì)：

3.仔細(xì)選擇目標(biāo)基因的編輯位點(diǎn)，確保編輯后的基因序列符合預(yù)期效果，并避免對(duì)細(xì)胞造成過(guò)大的毒性或致死效應(yīng)。

4.設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的sgRNA，確保CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確識(shí)別和切割目標(biāo)DNA序列。

5.Cas9/sgRNA載體的構(gòu)建與驗(yàn)證：

構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞Cas9/sgRNA載體，并驗(yàn)證其活性和效率?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測(cè)基因編輯效果來(lái)評(píng)估載體的有效性。

6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選：

使用合適的轉(zhuǎn)染方法將Cas9/sgRNA載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，確保轉(zhuǎn)染效率和基因編輯效率。通過(guò)篩選特定表型的細(xì)胞，如藥物抗性、熒光表達(dá)等，來(lái)富集基因編輯成功的細(xì)胞。

基因編輯效果的檢測(cè)：

7.采用基因組測(cè)序（NGS）等技術(shù)檢測(cè)基因編輯效果，包括目標(biāo)位點(diǎn)的突變情況、脫靶效應(yīng)等。確保編輯結(jié)果符合預(yù)期，并避免非目標(biāo)位點(diǎn)的突變。

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