RNA干擾（RNAi）是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達的過程，指利用內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。RNA干擾作為一種新型且強大的基因沉默工具，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和治療學(xué)研究，特別是針對癌癥或其他疾病治療中的無成藥性靶標(biāo)。

RNA干擾的發(fā)現(xiàn)歷程

? 1984年，反義RNA被發(fā)現(xiàn)能夠抑制基因的表達，且雙鏈RNA比單鏈RNA效果更佳。

? 1990年，Jorgensen研究小組在研究時，推測外源查爾酮合成酶基因抑制了內(nèi)源基因表達。

? 1992年，Romano和Macino在粗糙鏈孢霉中觀察到類似現(xiàn)象。

? 1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也觀察到了RNA干擾現(xiàn)象。

? 1998年，Andrew Z. Fire等在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）實驗中揭示雙鏈RNA的抑制效果強于正義或反義RNA，推測存在擴增效應(yīng)和酶活性參與，并命名為RNA干擾。

RNA干擾家族成員

RNA干擾由轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活，表現(xiàn)為小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）誘導(dǎo)實現(xiàn)靶mRNA降解的基因沉默；小RNA（miRNA）誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制；短反義核酸（siRNA和shRNA序列）對鎖定細胞的mRNA進行降解阻斷了該蛋白的進一步表達/聚集，導(dǎo)致其水平的下降，最終實現(xiàn)抑制作用。

siRNA VS miRNA

RNA干擾的技術(shù)要點

siRNA設(shè)計

? 嚴格配對：siRNA反義鏈與靶基因需嚴格堿基配對，避免單堿基錯配。

? 特異性：設(shè)計siRNA時，確保其與靶基因高度同源，減少與其他基因同源性。

? 序列選擇：

1. 從AUG下游找AA雙核苷酸，及其后19個核苷酸作為模板。

2. 每個基因選4-5個序列，通過生物信息學(xué)篩選特異性最強的。

3. 避開5'和3'非翻譯區(qū)及起始密碼子附近，減少調(diào)節(jié)蛋白競爭。

siRNA合成    

體外制備

? 化學(xué)合成：適用于已知有效序列，成本高，周期長。

? 體外轉(zhuǎn)錄：成本較低，速度快，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。

? RNase III消化：快速經(jīng)濟，用于研究基因功能缺失，可能引發(fā)非特異沉默。

體內(nèi)表達    

1. siRNA表達載體    

多數(shù)siRNA表達載體采用RNA聚合酶III（pol III）啟動子，如人/鼠U6和人H1，這些啟動子擅長在哺乳動物細胞中表達小分子RNA，并以一串（3-6個）U終止轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建時需訂購兩段編碼shRNA的DNA單鏈，退火后克隆至載體pol III啟動子下游，過程耗時數(shù)周至數(shù)月，需測序驗證。該載體優(yōu)點在于長期研究潛力，帶抗生素標(biāo)記的可持續(xù)抑制靶基因數(shù)周至更久。病毒載體則高效感染細胞，提升轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性和效率，適合基因沉默研究。

最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。

2. siRNA表達框架    

siRNA表達框架（SECs）為PCR產(chǎn)物，集成了RNA pol III啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA及終止位點，無需載體克隆即可直接導(dǎo)入細胞表達。相比傳統(tǒng)載體，SECs省去了克隆、測序等耗時步驟，快速高效，是篩選siRNA及優(yōu)化啟動子-siRNA組合的理想工具。若PCR設(shè)計時加入酶切位點，篩選出的高效siRNA可便捷克隆至載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達載體，用于長期抑制研究。這個方法的主要缺點是：

（1）PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中；

（2）不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子。

不適用于：長期抑制研究（如果克隆到載體后就可以了）。

RNA干擾（RNAi）技術(shù)的應(yīng)用

RNAi因其在基因沉默上的高效與簡便性，成為基因功能研究的利器。它模擬藥物抑制標(biāo)靶基因（疾病基因）的機制，采用功能丟失（LOF）策略優(yōu)于傳統(tǒng)功能獲得（GOF）法，故在制藥業(yè)中尤為關(guān)鍵，用于藥物靶標(biāo)驗證。有效的siRNA/shRNA不僅助力靶標(biāo)識別，更可潛力轉(zhuǎn)化為RNAi藥物。

RNAi技術(shù)在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與驗證中廣泛應(yīng)用，企業(yè)常利用RNAi文庫篩選細胞，通過表型變化識別功能基因，如抑制腫瘤生長的基因。若靶標(biāo)具備成藥潛力（如膜蛋白或分泌蛋白），則進一步開展大規(guī)模藥物篩選。同時，RNAi技術(shù)也用于細胞及動物模型中對靶標(biāo)的二次驗證。

臨床應(yīng)用中，雙鏈小分子RNA/siRNA已試用于多種疾病治療，如老年黃斑變性、ALS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肥胖等。在抗病毒及神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕。┑闹委熖剿髦?，RNAi療法初顯成效，腫瘤治療領(lǐng)域亦取得進展。

泓迅生物

RNAi設(shè)計與合成

泓迅生物提供高度定制化的siRNA和miRNA合成服務(wù)，通過精湛工藝和嚴格質(zhì)檢確保產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)。我們提供多樣化、經(jīng)化學(xué)修飾的siRNA，如磷酸、核糖和堿基修飾，以增強其體內(nèi)穩(wěn)定性和效果。同時，我們也供應(yīng)多種miRNA產(chǎn)品，包括模擬物、抑制劑和對照品，以滿足不同研究需求。

參考文獻

DOI: 10.1631/jzus.B1700594.