酵母表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的之一，其中巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）作為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的代表，近年來(lái)發(fā)展迅速，應(yīng)用廣泛。

畢赤酵母：基因表達(dá)的新紀(jì)元

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)誕生于上世紀(jì)80 年代初期，它融合了原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，迅速在眾多表達(dá)系統(tǒng)中脫穎而出。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，它不僅保留了操作簡(jiǎn)易、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)量高、成本低等特性，還具備原核生物所欠缺的對(duì)外源蛋白的翻譯后修飾能力，如糖基化、蛋白磷酸化等，使表達(dá)的重組蛋白更接近天然產(chǎn)物。同時(shí)，它又克服了釀酒酵母分泌效率差、表達(dá)菌株不穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，成為外源蛋白表達(dá)的理想選擇。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)

1. 高效AOX1啟動(dòng)子：目前最強(qiáng)、調(diào)控機(jī)制最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯?dòng)子之一，便于調(diào)控外源基因的表達(dá)。

2. 蛋白加工修飾功能：可對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化、脂類(lèi)?；确g后修飾，使重組蛋白與天然產(chǎn)物更相似。

3. 低成本與高效生長(zhǎng)：菌株生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)基成本低廉，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單。

4. 高表達(dá)量：外源蛋白表達(dá)量高，支持胞內(nèi)和分泌表達(dá)。

5. 基因穩(wěn)定整合：外源基因能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝形式穩(wěn)定整合，可穩(wěn)定遺傳50代以上。

6. 高密度發(fā)酵：耐受高密度發(fā)酵，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

P. pastoris生產(chǎn)重組蛋白的流程

畢赤酵母菌株多樣性

當(dāng)前所采用的巴斯德畢赤酵母菌株都源自原始的Y-11430菌，常用的有GS115、KM71、X33和SMD1168等。蛋白胞內(nèi)表達(dá)優(yōu)先選MutS表型，分泌表達(dá)Mut + 和MutS均可；多數(shù)菌株如SMD1168、GS115、KM-71是組氨酸脫氫酶缺陷型，可用不含組氨酸培養(yǎng)基篩選重組子，且SMD1168為蛋白酶缺陷型，適合表達(dá)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物以避免內(nèi)源性蛋白酶降解。但SMD1168菌株生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量低

畢赤酵母常用表達(dá)載體

畢赤酵母表達(dá)載體分為分泌型和非分泌型兩大類(lèi)，分別適用于不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求，其中分泌型載體利用釀酒酵母的分泌信號(hào)序列，有效引導(dǎo)外源蛋白的分泌，提高了蛋白的產(chǎn)量和純度。因此，深入了解和優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)載體，對(duì)于提升蛋白生產(chǎn)效率和質(zhì)量至關(guān)重要，也是當(dāng)前生物技術(shù)和基因工程研究中的熱點(diǎn)之一。

常見(jiàn)的用于生產(chǎn)分泌蛋白的畢赤酵母表達(dá)載體【1】

常見(jiàn)的用于生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白的畢赤酵母表達(dá)載體【1】

畢赤酵母基因改造技術(shù)

1. 基于線性化質(zhì)粒載體的同源重組

同源重組技術(shù)是一種利用生物體自身修復(fù)機(jī)制的基因工程技術(shù)。在畢赤酵母中，通過(guò)將線性化的質(zhì)粒載體引入，可以高效地將外源基因整合到宿主基因組的特定位點(diǎn)。這一過(guò)程依賴(lài)于同源臂序列，這些序列與目標(biāo)基因組區(qū)域具有高度相似性，從而促進(jìn)了質(zhì)粒載體與宿主DNA之間的重組。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于其操作簡(jiǎn)便、整合效率高，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的多拷貝插入，這對(duì)于提高基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)產(chǎn)量至關(guān)重要。在工業(yè)生產(chǎn)中，這種技術(shù)常被用于優(yōu)化基因表達(dá)，以滿(mǎn)足生物制藥和工業(yè)酶生產(chǎn)的需求。此外，同源重組技術(shù)還可以用于基因功能研究、疾病模型構(gòu)建以及生物技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

2. 基于CRISPR/Cas9的基因編輯

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種革命性的基因編輯技術(shù)，它通過(guò)利用指導(dǎo)RNA（gRNA）引導(dǎo)核酸酶Cas9精確切割目標(biāo)DNA序列。這種特異性的切割觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。CRISPR/Cas9技術(shù)以其高效性和精準(zhǔn)性在基因組編輯領(lǐng)域占據(jù)重要地位，特別適用于復(fù)雜代謝途徑的優(yōu)化和多基因編輯。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas9技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、菌株改良以及生產(chǎn)性能的提升。例如，通過(guò)敲除或替換特定基因，可以增強(qiáng)宿主菌的蛋白質(zhì)表達(dá)能力或改變其代謝特性，以適應(yīng)特定的工業(yè)生產(chǎn)需求。

3. 基于CRISPR/Cas12的基因編輯

CRISPR/Cas12系統(tǒng)，也稱(chēng)為Cpf1，是CRISPR家族中的另一種基因編輯工具。Cas12蛋白具有廣泛的靶向能力和單鏈DNA切割特性，使其在基因組編輯中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與Cas9相比，Cas12對(duì)靶位點(diǎn)的PAM（原始間隔短回文重復(fù)序列）依賴(lài)性更寬松，這為基因編輯提供了更大的靈活性。CRISPR/Cas12系統(tǒng)在表觀遺傳調(diào)控和新型生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)中展現(xiàn)出巨大潛力，例如，它可以用于研究基因沉默、激活以及DNA甲基化等表觀遺傳修飾。此外，Cas12的單鏈切割特性使其在開(kāi)發(fā)新型核酸檢測(cè)技術(shù)、基因治療策略以及合成生物學(xué)應(yīng)用中具有獨(dú)特的應(yīng)用前景。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas12技術(shù)的應(yīng)用還相對(duì)較新，但已有研究表明，它在基因組編輯和基因功能研究中具有巨大的潛力。

畢赤酵母創(chuàng)新突破

經(jīng)過(guò)幾十年的廣泛應(yīng)用，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功表達(dá)了數(shù)以千計(jì)的異源蛋白，其中大部分為醫(yī)藥制品。美國(guó)FDA 對(duì)該系統(tǒng)的認(rèn)可，如 Cephelon 制劑的獲批，充分證明了其安全性和有效性。在我國(guó)，雖然目前上市的基因工程藥物大多源于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，但畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)憑借其國(guó)際上的廣泛認(rèn)可，必將在未來(lái)的醫(yī)藥市場(chǎng)中占據(jù)重要地位。

泓迅生物

酵母基因編輯 & 重組蛋白表達(dá)平臺(tái)

泓迅生物利用CRISPR等新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)畢赤酵母基因組的精準(zhǔn)編輯，包括基因敲除、插入和替換。我們成功敲除了GS115菌株的KU70基因，顯著提高了畢赤酵母的重組效率和外源基因的整合頻率，同時(shí)敲除了pep4基因，降低了外源蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn)。

我們深耕合成生物學(xué)領(lǐng)域，擁有豐富的基因合成、重組蛋白表達(dá)和基因編輯經(jīng)驗(yàn)。我們提供一站式解決方案，幫助解決畢赤酵母蛋白表達(dá)和基因改造的需求，最大限度縮短研發(fā)周期。

》案例展示

通過(guò)對(duì)畢赤酵母GS115的基因改造，提高了菌株對(duì)外源蛋白的表達(dá)和分泌。并利用該重組菌株成功表達(dá)了多個(gè)人源重組蛋白的高效分泌表達(dá)，培養(yǎng)液中雜蛋白很少，產(chǎn)量預(yù)計(jì)可達(dá)10g/L。

》免費(fèi)樣品測(cè)試

· 可免費(fèi)提供少量蛋白樣品以供測(cè)試。

· 菌株、蛋白等相關(guān)信息可聯(lián)系本司咨詢(xún)。

填寫(xiě)申請(qǐng)

未來(lái)展望

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以其高表達(dá)、高密度、多樣化翻譯后修飾以及無(wú)內(nèi)毒素和病毒的安全性等優(yōu)勢(shì)，成為重組蛋白表達(dá)的優(yōu)選平臺(tái)。CRISPR/Cas9等基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用將進(jìn)一步推動(dòng)該系統(tǒng)的發(fā)展，助力重組人源蛋白在生物醫(yī)藥、美容護(hù)膚等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

重組膠原蛋白基因的選擇和設(shè)計(jì)、表達(dá)條件的優(yōu)化和驗(yàn)證對(duì)于獲得高產(chǎn)量的蛋白至關(guān)重要。泓迅生物提供從“序列優(yōu)化”到“基因合成”到“重組膠原蛋白表達(dá)”一站式服務(wù)。高效的基因合成、多種表達(dá)體系協(xié)助您在實(shí)驗(yàn)室低成本無(wú)限合成，提高膠原蛋白的表達(dá)量、親水性和可加工性，創(chuàng)造更多應(yīng)用可能。

參考文獻(xiàn)

[1] Karbalaei M, Rezaee S A, Farsiani H. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins[J]. Journal of cellular physiology, 2020, 235(9): 5867-5881.

[2] De S, Mattanovich D, Ferrer P, Gasser B. Established tools and emerging trends for the production of recombinant proteins and metabolites in Pichia pastoris. Essays Biochem. 2021 Jul 26;65(2):293-307.

[3] Cos, O. et al. (2006). Microbial Cell Factories, 5, 1-20.
[4] Staley, C. A. et al. (2012). Gene, 496(2), 118-127.
[5]覃曉琳et al. (2010).生物技術(shù), 20(3), 4.
[6]周則迅&袁漢英. (2000).復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版(3), 264-268.
[7] Siegel, R. S. & Brierley, R. A. (1989). Biotechnology and bioengineering, 34(3), 403-404.
[8] Liu, Q. et al. (2019). Microbial cell factories, 18, 1-11.